褐藻胶是由1,4-β-D-甘露糖醛酸(1,4-β-D-mannuronic acid, M)和1,4-α-L-古罗糖醛酸(1,4-α-L-guluronic acid, G)两种糖醛酸单体通过α/β-1,4糖苷键链接，随机排列成的线性高分子，无分支和侧链(Gacesa, 1992)，是一种极具应用价值的多糖类物质。大分子的褐藻胶可以被降解成由2~20单糖聚合而成的寡糖片段，从而表现出多种生物活性，在食品、医疗及工业生产等行业应用广泛。常用的褐藻胶降解方法有物理降解法(Holme et al., 2003; 蒋林斌和谢天俊, 2000)、化学降解法(杨钊等, 2004)和生物降解法(Nakada and Sweeny, 1967)，工业生产现主要以物理降解法和化学降解法为主，但物理降解法操作复杂，对设备要求较高，难以将褐藻胶完全降解(Toshio et al., 1983)；化学降解法中酸降解法较为常用，但降解反应条件剧烈，降解后产生的废弃物较多，对环境有较大的危害(Rehm, 1998)。生物降解法尤其是微生物降解褐藻胶，因其专一性高、反应条件温和以及褐藻寡糖得率高等优点，受到越来越多的关注。

褐藻胶裂解酶来源广泛，如海洋和土壤微生物(Dong et al., 2012; 黄李淑馨等, 2013; 王熙涛等, 2014, 中国饲料, (4): 27-31)、海洋动物(朱仁华, 1983, 海洋学报(中文版), 5(Sup): 899-906)等。微生物是褐藻胶裂解酶的重要来源之一，包括海洋弧菌(李京宝等，2003)、交替假单胞菌(Li et al., 2011)、盐单胞菌(李恒等, 2014)等。但现有微生物源的褐藻胶裂解酶依然存在着酶活力较低、作用位点单一等缺陷，因此寻找新的产褐藻胶裂解酶菌株以及不同类型的褐藻胶裂解酶是当下的研究热点和趋势。本研究从海洋大型褐藻--马尾藻及其生境底泥混合样品中分离能降解褐藻胶的细菌，并对酶活较高的菌株DB15913通过形态学和16S rDNA系统发育分析进行了鉴定，对其产酶能力进行初步测定，为褐藻胶裂解酶的生产和工业应用提供了一个新的菌种资源。

1结果与分析

1.1产酶菌株的初筛

通过以0.5%褐藻酸钠为唯一碳源的培养基定向分离，从腐烂的马尾藻及其生境底泥混合样品中共分离得到18株细菌。将18株细菌点接在初筛平板上，用95%酒精处理后均显现出明显的水解圈，其中水解圈与菌落的直径比值D/d≥5的有13株，D/d≥8的有3株(图1)。水解圈显现出两种明显不同的类型，一般认为古罗糖醛酸特异性的褐藻胶裂解酶产生白色圈状水解圈，而甘露糖醛酸特异性的褐藻胶裂解酶产生白色环状水解圈(Hisano et al., 1994) (图2)。初筛得到的18株细菌中，菌株DB15899、DB15901、DB15902表现为甘露糖醛酸特异性(EC4.2.2.3)，其余菌株表现为古罗糖醛酸特异性(EC4.2.2.11)。

图1产酶细菌水解圈与菌落直径比值(D/d) Figure 1 Diameter ratios of hydrolyzation circle and colony (D/d) of enzyme-producting bacterias

图2两种不同褐藻胶裂解酶活性水解圈 注: A: 古罗糖醛酸特异性; B: 甘露糖醛酸特异性 Figure 2 Two kinds of hydrolyzation circles of different alginate lyases Note: A: Guluronate-specific alginate lyase; B: Mannuronate-specific alginate lyase

1.2产酶菌株的复筛

选取D/d≥5并且生长良好的6株细菌，采用DNS法测定其褐藻胶裂解酶酶活，其中菌株DB15913酶活最高，达到15.42 U/mL (图3)。

1.3菌株DB15913的形态学特征及部分生理生化特征

菌株DB15913在以褐藻胶为单一碳源的分离培养基上生长良好，菌落圆形，直径2~3 mm，乳白色或乳黄色，半透明，表面光滑、湿润、无褶皱。菌苔粘稠，不易挑起。菌体短小呈椭圆形，革兰氏阴性菌(图4)。菌株DB15913可在20~42℃的温度范围及0%~20%的NaCl浓度范围内生长，最适温度为25℃，最适pH为8.5。其余生理生化特征列于表中(表1)。

表1菌株DB15913生理生化特征 注: “＋”表示阳性或能够利用; “－”表示阴性或不能利用 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain DB15913 Note: Positive: ＋; Negetive: －

1.4 16S rDNA与系统发育分析

菌株DB15913测序后序列已提交到GenBank数据库中，登录号为KU529687。将序列在Eztaxon数据库中比对后结果显示菌株DB15913与Cobetia amphilecti同源性最高，达到99.72%。与Cobetia litoralis、Cobetia marina、Cobetia pacifica同源性均为99.58%。从系统发育树可以看出，菌株DB15913与Cobetia amphilecti聚为同一分支，亲缘关系最近(图5)。结合菌株形态特征和生理生化特征，鉴定菌株DB15913属于Cobetia属，为Cobetia amphilecti。 

图5菌株DB15913系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of strain DB15913

2讨论

本研究以褐藻酸钠为单一碳源，从海南岛腐烂的马尾藻和马尾藻生境底泥混合样品中共分离出18株可降解褐藻酸钠的细菌。通过平板水解圈初筛和液体发酵复筛，获得一株褐藻胶裂解酶活性较高的菌株DB15913。测定菌株酶活时发现，当褐藻胶裂解酶将培养基中的褐藻胶降解成小分子的寡糖时，经过95%酒精的处理，会在培养基上形成水解圈，理论上如果酶活性越高，水解圈越大，水解圈与菌落直径的比值(D/d)较能准确的表示酶活力的大小。但是将图2和图3的数据对比后发现，6株细菌的D/d值与酶活力值并没有呈现出线性关系。菌株DB15904的D/d值最大达到了9.33，但其褐藻胶裂解酶活力为15.01 U/mL，低于菌株DB15913的15.42 U/mL。分析其原因可能为菌株在培养基上形成的水解圈会受到多方面的影响，比如菌株分泌褐藻胶裂解酶有快有慢、培养基的均匀程度不同、培养基的薄厚不均一等都会使水解圈产生不同的变化，导致D/d值与酶活力值不成线性相关，甚至同一菌株不同平行间的D/d值也会有一定幅度的变化。因此，D/d值只可以作为大批量初筛时的参考指标，必须结合酶活值才能确定菌株的酶活力高低。最终测定菌株DB15913褐藻胶裂解酶酶活力为15.42 U/mL，后期可经过优化发酵培养基和发酵条件进一步提高酶活力。

经过菌株形态学观察、生理生化特征鉴定和16S rDNA系统发育分析，鉴定菌株DB15913为Cobetia amphilecti。现已报道的褐藻胶裂解酶多是从海带、以褐藻为食的海洋动物和土壤中获得，产褐藻胶裂解酶的菌株多为弧菌属和假单胞菌属。Cobetia属的报道较少，Cobetia amphilecti未见有报道，也未见从热带马尾藻生境中分离得到产褐藻胶裂解酶细菌的报道，本研究为褐藻胶裂解酶的生产和应用提供了新的材料来源和菌种资源。

3材料与方法

3.1样品来源

本实验所用的马尾藻及其所在生境底泥样品，均采自海南省儋州市海头镇沿海区域。此区域人为干扰较少，较能避免外界因素对样品的影响。

3.2主要试剂与培养基

海藻酸钠购自上海源叶生物科技有限公；3,5-二硝基水杨酸购自国药集团化学试剂有限公司；2×Es Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；DM2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；16S rDNA基因扩增引物由生工生物工程股份有限公司合成；其余试剂均为国产分析纯。

分离培养基：褐藻酸钠5 g、(NH₄)₂SO₄ 5 g、K₂HPO₄ 2 g、NaCl 5 g、MgSO₄·7H₂O 1 g、FeSO₄·7H₂O 0.01 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.5。初筛培养基与分离培养基相同。种子培养基和发酵培养基为不添加琼脂的分离培养基。所有培养基121℃湿热灭菌20 min。

3.3产酶菌株的分离

将采回的马尾藻样品与其生境底泥样品充分混合，置于塑料箱中，静置3 d，使藻体自然腐烂。称取10 g混合样品，置于装有90 mL无菌水及玻璃珠的250 mL锥形瓶中，200 r/min振荡30 min，使样品分散均匀。静置震荡后的悬液5 min，使较大颗粒物质沉降，取上清液做10倍梯度稀释。取原液、10^-1、10^-2三个稀释度涂布于分离平板，每个稀释度设3个平行。将平板置于28℃培养箱中培养3~5 d，挑选生长状态良好、形态不同的菌落进行划线培养，经多次纯化后得到纯的菌株。

3.4产酶菌株的初筛

用灭菌牙签挑取待检测菌落点接到初筛平板上，28℃培养3 d。使用95%酒精处理平板显现水解圈，分别测量菌落直径(d)和水解圈直径(D)，以水解圈直径和菌落直径比值(D/d)作为初筛指标。

3.5产酶菌株的复筛

选取生长良好、水解圈明显的菌株，转接至种子培养基中，28℃、200 r/min振荡培养24 h。按照3%接种量将种子液接种于液体发酵培养基中，28℃、200 r/min振荡培养3 d。取发酵液，4℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗酶液测定褐藻胶裂解酶酶活，以酶活力大小作为复筛指标。

绘制葡萄糖标准曲线，采用DNS法测定粗酶液中褐藻胶裂解酶酶活。每组添加2 mL 0.3%褐藻酸钠，0.5 mL粗酶液。实验组40℃水浴30 min后添加1.5 mL DNS试剂，沸水浴3 min。对照组不水浴直接添加1.5 mL DNS试剂后沸水浴3 min。冷却后定容到25 mL，在540 nm波长下比色，对照标准曲线求出褐藻胶酶活力。定义1个酶活单位(U)为酶在最适反应温度下，单位时间内将底物水解产生1 μmol还原糖所需要的酶量。DNS试剂采用Ghose法配置(王俊丽等, 2010)，静置7~10 d后使用。

3.6菌株DB15913的形态学观察及生理生化特征鉴定

对复筛选取出的菌株，观察其固体培养基上菌落形态。用光学显微镜对菌株的菌体形态进行显微观察。部分生理生化特征鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英, 2001,科学出版社, pp.364-398)。

3.7菌株DB15913 16S rDNA序列测定与系统发育树构建

挑取待测序菌株至装有500 μL发酵培养基的2 mL离心管中，28℃，200 r/min振荡培养24 h，以菌液作为DNA模板进行16S rDNA的菌液PCR扩增。所用引物为P1/P6，P1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT；P6：TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC。PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR扩增产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在GenBank中进行序列比对，比对结果使用Clustal X进行多序列比对，并使用MEGA5.0软件进行聚类分析和同源性分析，以Neighbor-Joining法构建系统发育树，确定菌株的种属分类(宋敏等, 2015)。

作者贡献

宋鑫负责本研究的实验方案设计、实验操作、文献查阅和论文攥写工作；朱军和黄惠琴负责实验指导和论文的修改；秦送玉参与了部分实验研究；孙前光负责实验材料的采集和前期处理；鲍时翔为通讯作者并负责实验方案的确定和论文修改与审核。

致谢

本研究由海洋公益性行业科研专项(20144180402)、国家海洋经济创新发展区域示范项目(12PYY001SF08-ZGRKY-1)、海南省科技兴海专项(XH201408)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ITBB2015RC07; 1630052015038)共同资助。

参考文献

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